Autoradiographie
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Autoradiographie (häufige Abkürzung AURA) bezeichnet die Sichtbarmachung einer chemischen Komponente durch radioaktive Isotope, ursprünglich durch Schwärzung eines fotografischen Filmes, inzwischen vermehrt mit Hilfe eines Strahlungsdetektors.
[Bearbeiten] Anwendungen
Die Autoradiographie war über drei Jahrzehnte hin ein integraler Bestandteil der DNA-Sequenzanalyse nach Sanger. Seit den letzten Jahren des 20. Jahrhunderts werden allerdings vermehrt fluoreszierende anstelle von radioaktiv markierten DNA-Nukleotiden zur Sequenzanalyse benutzt.
Autoradiographie findet weiterhin Verwendung bei der Produktion von rekombinanten Proteinen, Analyse von enzymatischen Reaktionen, oder Identifizierung von Enzym-Substraten.
Außerdem wird sie in der Pharmakokinetik angewendet, um Absorption Distribution Metabolism Excretion-Studien (ADME) zu erstellen.
[Bearbeiten] Durchführung
Allen Anwendungen der Autoradiographie gemeinsam ist die Notwendigkeit, radioaktive Isotope in die zu analysierenden Moleküle einzuschleusen. Aufgrund des häufigen Vorkommens der korrespondierenden stabilen Isotope in Biomolekülen und ihrer relativ geringen Gefährlichkeit werden häufig die Radioisotope 14C (Kohlenstoff), 35S (Schwefel), 32P (Phosphor) und 3H (Tritium) eingesetzt.
1. Beispiel – Markierung rekombinanter Proteine
Ein mit einem Expressionsplasmid transfizierter Bakterienstamm wird mit einem Nährmedium versetzt, das die radioaktiv markierte Aminosäure 35S-Methionin enthält. 35S-Methionin wird in das rekombinante Protein, das auf dem Plasmid kodiert ist, eingebaut. Ein Bakterienextrakt wird per SDS-PAGE aufgetrennt, das Gel wird getrocknet, und ein Film wird aufgelegt. Nach „Belichtung“ des Films durch Betastrahlen ist auf dem entwickelten Film die Position des rekombinanten Proteins sichtbar.
2. Beispiel – Analyse von Enzymaktivität
Eine ATPase, also ein Enzym, das das Nukleotid ATP spaltet, wird mit radioaktiv markiertem 32P-ATP inkubiert. Die Mischung wird nach unterschiedlichen Zeiten durch Dünnschichtchromatografie aufgetrennt, die Chromatographieplatte wird getrocknet und auf Film gelegt. Die Schwärzung des Films durch 32P-Phosphat spiegelt die Aktivität des Enzyms wider.
