Microscope confocal
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Vous avez de Un microscope confocal est un système pour lequel l'illumination et la détection sont limités à un même volume de taille réduite: le point focal.
L'image confocale (ou coupe optique) est ensuite obtenue par le déplacement de ce point de focalisation de la lumière d'excitation dans les trois dimensions de l'échantillon XYZ.
[modifier] Obtention du point focal
Décrite pour la première fois par Minsky (1957), la technique d'imagerie confocale de fluorescence représente une avancée technologique importante puisqu'elle permet d'obtenir des images de grande résolution qui sont comme des coupes "optiques" d'une épaisseur d'environ 0.4µm, obtenues à différents niveaux dans l'épaisseur d'un échantillon. Basée sur l'élimination des signaux de fluorescence provenant des régions situées en dehors du plan focal, cette technique donne ainsi accès à des informations situées à l'intérieur des cellules.
Depuis le modèle d'étude de Minsky qui utilisait une lumière d'excitation diffuse générée par une lampe (plus une fenètre), deux évolutions technologiques ont contribuées à l'augmentation de la résolution des images confocales:
- L'utilisation d'un laser comme source d'excitation constitue une source de lumière facilement focalisable. En effet, la lumière laser est cohérente, unidirectionnelle et composée d'une ou plusieurs couleurs très pures (ondes de même fréquence et parfaitement en phase).
- L'utilisation d'objectif possédant une grande ouverture numérique (N.A, numerical aperture) assure une focalisation de la source lumineuse en un point de petite taille.
Il existe aujourd'hui deux types de systèmes confocaux:
- Le système confocal multiphoton
- utilise des lumières d'excitation près de l'infrarouge. Dans ce cas, seul le point de focalisation du faisceau laser est excitateur (densité de photon suffisante pour coupler l'énergie d'excitation). Ce système est considéré comme une évolution technologique importante pour trois raisons majeures :
- Il ne nécessite pas d'iris confocal.
- L'utilisation d'une lumière d'excitation à une longueur d'onde élevée (>900nm) assure une plus grande pénétration à l'intérieur de l'échantillon (jusqu'à 500µm au lieu de 150µm) offrant la possibilité de travailler sur des échantillons plus épais.
- L'excitation des fluorophores étant limitée au point de focalisation du faisceau laser, le risque de photoblanchiement est réduit.
En pratique, le rendement d'émission de fluorescence est moins bon qu'un confocal simple photon et le rapport signal/bruit est plus faible. Ainsi, il ne montre que peu d'avantage pour l'observation de cellules en culture ou de coupes de tissu (50-70µm d'épaisseur).
- Le système confocal simple photon
- utilise une lumière d'excitation dont la longueur d'onde excite directement le fluorophore. Ainsi, la fluorescence émise peut provenir de toute l'épaisseur de l'échantillon traversée par le faisceau laser. L'élément clé de ce microscope confocal est alors représenté par une fenêtre (ou iris confocal) placée devant le photodétecteur qui élimine la fluorescence provenant des régions non focales. L'observation de signaux fluorescents repose sur quatre éléments clés :
- une source de lumière pour l'excitation,
- un fluorophore,
- des filtres pour séparer les photons d'émission des photons d'excitation,
- un détecteur qui enregistre l'émission de photon et transforme ce signal lumineux en signal électrique ou en image photographique. Pour la microscopie confocale, la lumière d'excitation est délivrée par un laser et la détection est assurée soit par une caméra CCD haute sensibilité soit par des photomultiplicateurs.
