Terapia genética
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Terapia genética ou terapia gênica é a inserção de genes nas células e tecidos de um indivíduo para o tratamento de uma doença; em especial, doenças hereditárias. A terapia genética visa a suplementar com alelos funcionais aqueles que são defeituosos. Embora a tecnologia ainda esteja em seu estágio inicial, tem sido usada com algum sucesso.
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[editar] Histórico
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Na década de 80, avanços na biologia molecular já permitiam que os genes humanas fossem seqüenciados e clonados. Cientistas que procuravam por um método para facilitar a produção de proteínas — tais como insulina — pesquisaram a introdução de genes humanos no DNA de bactérias. As bactérias geneticamente modificadas passaram, então, a produzir a proteína correspondente, que podia ser recolhida e injetada em pessoas que não a podiam produzir naturalmente.
Em 14 de setembro de 1990 pesquisadores do National Institutes of Health, nos Estados Unidos, realizaram a primeira terapia genética autorizada em Ashanti DeSilva, de 4 anos de idade. Nascida com uma rara doença genética chamada Imunodeficiência Combinada Grave, ela não tinha um sistema imunológico saudável, e era vulnerável a todos os germes com que tivesse contato. Crianças com essa doença geralmente desenvolvem muitas infecções e raramente sobrevivem à idade adulta.
Na terapia genética realizada em Ashanti, os médicos recolheram glóbulos brancos do corpo da criança, e cultivaram as células em laboratório. No segundo momento, inseriram o gene que faltava nas células e reintroduziram os glóbulos brancos geneticamente modificados na corrente sangüínea da paciente. Exames de laboratório mostraram que a terapia fortaleceu o sistema imunológico de Ashanti; ela parou de contrair resfriados recorrentes e pôde voltar a freqüentar a escola. Esse procedimento não a curou; os glóbulos brancos tratados geneticamente só funcionaram por poucos meses, e o processo teve de ser freqüentemente repetido. (VII, Thompson, 1993).
Embora essa explicação simplificada de terapia genética possa soar como um final feliz, é apenas um capítulo inicial otimista numa longa história. O percurso até a primeira terapia genética autorizada foi conturbado e cheio de controvérsia. A biologia da terapia genética em humanos é muito complexa, e há ainda muitas técnicas que precisam ser desenvolvidas e doenças que precisam ser entendidas de maneira mais completa antes que a terapia genética possa ser usada apropriadamente.
Cientistas tomaram a iniciativa de tentar introduzir genes diretamente nas células humanas, focando doenças causadas por defeitos em genes simples, tais como fibrose cística, hemofilia e distrofia muscular. Entretanto, esse objetivo foi muito mais difícil de se alcançar que modificar bactérias simples, principalmente por causa dos problemas envolvidos no transporte de grandes seções de DNA e na seu posicionamento no lugar certo do genoma.
[editar] Processo básico
Na maioria dos estudos a respeito de terapia genética, um gene "normal" é inserido no genoma para substituir um gene "anômalo" causador de doença. Uma molécula transportadora, chamada vetor, precisa ser usada para se enviar o gene terapêutico para as células-alvo do paciente. Atualmente, o vetor mais comum é um vírus que foi geneticamente alterado para transportar DNA humano normal. Vírus evoluíram de forma a encapsular e transportar seus genes para células humanas, causando doenças. Cientistas tentaram aproveitar essa capacidade e manipular o genoma dos virus, removendo os genes causadores de doença e inserindo genes terapêuticos.
Células-alvo, tais como células do fígado ou dos pulmões do paciente, são infectadas com o vetor. O vetor, então, descarrega seu material genético, contendo o gene terapêutico humano, na célula-alvo. A produção de proteínas funcionais pelos genes terapêuticos restauram as células-alvo a um estado de normalidade.
[editar] Tipos de terapia genética
Teoricamente é possível transformar tanto células somáticas (a maior parte de células do corpo) quanto células germinativas (espermatozóides, óvulos, e suas células-tronco precursoras). Todas as terapias genéticas realizadas até agora em humanos foram dirigidas a células somáticas, enquanto a engenharia de células germinativas continua altamente controversa. Para que os genes introduzidos sejam transmitidos normalmente para a descendência, é necessário não apenas que sejam inseridos na célula, mas também que sejam incorporadas aos cromossomos por recombinação genética.
A terapia genética com genes somáticos pode ser dividida em duas grandes categorias: ex vivo (em que as células são modificadas fora do corpo e, então, transplantadas novamente para o paciente) e in vivo (em que os genes são modificados nas células ainda dentro do corpo). Abordagens in vivo baseadas em recombinação são especialmente incomuns.
[editar] Métodos
Existe uma variedade de métodos diferentes para substituir ou reparar os genes focados na terapica genética.
- Um gene normal pode ser inserido num local não específico no genoma para substituir um gene problemático. Essa abordagem é a mais comum.
- Um gene anômalo pode ser trocado por um gene normal por meio da recombinação.
- O gene anômalo pode ser reparado por meio de mutação reversa seletiva, que devolve ao gene suas funções normais.
- A regulação (o grau em que um gene está ativo ou inativo) de um gene em particular pode ser alterada.
[editar] Vetores da terapia genética
[editar] Vírus
Todos os vírus atacam o seu hospedeiro e introduzem seu material genético na célula hospedeira como parte de seu ciclo de replicação. Esse material genético contém 'instruções' básicas sobre como produzir mais cópias desses vírus, "seqüestrando" o mecanismo de produção normal do corpo para servir às necessidades do vírus. A célula hospedeira recebe essas instruções e produz cópias adicionais do vírus, infectando mais e mais células. Alguns tipos de vírus fisicamente inserem seus genes no genoma do hospedeiro (uma característica que define os retrovírus, a família de vírus que inclui o HIV).
Médicos e biólogos moleculares perceberam que vírus como esses podiam ser usados como veículos para levar genes 'bons' ao interior de células humanas. Primeiro, um cientista remove os genes causadores de doença do vírus. Então, substitui-se esses genes com genes que produzem o efeito desejado (por exemplo, produção de insulina). Esse procedimento precisa ser feito de maneira que não se retirem os genes que dão ao vírus a capacidade de inserir seus genes no genoma do hospedeiro. Para tanto, é necessário muita pesquisa para conhecer muito bem os genes do vírus e saber a função de cada um.
[editar] Retrovírus
O material genético em retrovírus está na forma de moléculas de RNA, enquanto o material genético de seus hospedeiros está na forma de DNA. Quando um retrovírus infecta uma célula hospedeira, ele introduz seu RNA junto com algumas enzimas na célula. Essa molécula de RNA do retrovírus deve produzir uma cópia de DNA a partir de si própria antes que possa ser considerada parte do material genético da célula hospedeira. O processo de produzir uma cópia de DNA a partir de uma molécula de RNA é denominado transcrição reversa. Esta é executada por uma das enzimas carregada pelo vírus, chamada transcriptase reversa. Após essa cópia de DNA ser produzida e estar livre no núcleo da célula hospedeira, ela deve ser incorporada no genoma da célula hospedeira. isto é, ela deve ser inserida nas grandes moléculas de DNA na célula (os cromossomos). Este processo é feito por uma outra enzima carregada pelo vírus, chamada integrase.
Quando o material genético do vírus está incorporado e se tornou parte do material genético da célula hospedeira, nós podemos dizer que a célula hospedeira está modificada por conter um novo gene. Se essa célula hospedeira se dividir posteriormente, todas as suas descendentes conterão os novos genes.
Um dos problemas da terapia gênica usando retrovírus é que a enzima integrase pode inserir o material genético da vírus em qualquer posição arbitrária no genoma do hospedeiro. Se acontece do material genético ser inserido no meio de um dos genes originais da célula hospedeira, estes genes serão interrompidos (mutagênese por inserção). Se acontece do gene ser um que regula a divisão celular, uma divisão celular incontrolável (isto é, câncer) pode ocorrer. Este problem começou recentemente a ser tratado pela utilização de nucleases de dedo de zinco[1] ou pela inclusão de certas seqüências tal como a região de controle do lócus da beta-globina[6] para direcionar o sítio de integração para sítios cromossômicos específicos.
Testes de teragia genética para tratar a imudeficiência combinada grave (IDCG) foram interrompidos ou restritos nos EUA quando foi relatada leucemia em três de onze pacientes tratados no teste de terapia genética de IDCG ligada a X de Terapia Francesa (XIDCG). Dez pacientes de XIDCG tratados na Inglaterra não apresentaram leucemia até hoje e tiveram sucesso similar na reconstituição imune. Teste de terapia gênica para tratar IDCG devida a deficiência da enzima Adenosina Desaminase (ADA) continuam com relativo sucesso nos EUA, Itália e Japão.
[editar] Adenovírus
Adenovírus são vírus que possuem seu material genético na forma de um DNA dupla-hélice. Eles causam infecções respiratórias (especialmente a gripe comum), intestinais e oculares em humanos. Quando infectam uma célula hospedeira, esses vírus introduzem sua molécula de DNA. O material genético dos adenovírus não são incorporados ao material genético da célula hospedeira. A molécula de DNA fica livre no núcleo da célula hospedeira, e as instruções nessa molécula de DNA extra são transcritas como qualquer outro gene. A única diferença é que esses genes extras não são replicados quando a célula está prestes a se dividir, assim os decendentes daquela célula não terão o gene extra. As a result, treatment with the adenovirus will require readministration in a growing cell population although the absence of integration into the host cell's genome should prevent the type of cancer seen in the SCID trials. This vector system has shown real promise in treating cancer and indeed the first gene therapy product to be licenced is an adenovirus to treat cancer.
[editar] Adeno-associated viruses
Adeno-associated viruses, from the parvovirus family, are small viruses with a genome of single stranded DNA. These viruses can insert genetic material at a specific site on chromosome 19. There are a few disadvantages to using AAV, including the small amount of DNA it can carry (low capacity) and the difficulty in producing it. This type of virus is being used, however, because it is non-pathogenic (most people carry this harmless virus). In contrast to adenoviruses, most people treated with AAV will not build an immune response to remove the virus and the cells that have been successfully treated with it. Several trials with AAV are on-going or in preparation, mainly trying to treat muscle and eye diseases; the two tissues where the virus seems particularly useful. However, clinical trials have also been initiated where AAV vectors are used to deliver genes to the brain. This is possible because AAV viruses can infect non-dividing (quiescent) cells, such as neurons in which their genomes be expressed for a long time. In recent human trials, CD8+ immune cells have recognised the AAV infected cells as compromised and killed these cells accordingly. This action appears to be triggered by part of the capsid or outer coat of the type 2 virus. Recent studies have shown that humans will likely react in the same way against the new serotype 8 AAV as well.
[editar] Envelope protein pseudotyping of viral vectors
The viral vectors described above have natural host cell populations that they infect most efficiently. Retroviruses have limited natural host cell ranges, and although adenovirus and adeno-associated virus are able to infect a relatively broader range of cells efficiently, some cell types are refractory to infection by these viruses as well. Attachment to and entry into a susceptible cell is mediated by the protein envelope on the surface of a virus. Retroviruses and adeno-associated viruses have a single protein coating their membrane, while adenoviruses are coated with both an envelope protein and fibers that extend away from the surface of the virus. The envelope proteins on each of these viruses bind to cell-surface molecules such as heparin sulfate, which localizes them upon the surface of the potential host, as well as with the specific protein receptor that either induces entry-promoting structural changes in the viral protein, or localizes the virus in endosomes wherein acidification of the lumen induces this refolding of the viral coat. In either case, entry into potential host cells requires a favorable interaction between a protein on the surface of the virus and a protein on the surface of the cell. For the purposes of gene therapy, one might either want to limit or expand the range of cells susceptible to transduction by a gene therapy vector. To this end, many vectors have been developed in which the endogenous viral envelope proteins have been replaced by either envelope proteins from other viruses, or by chimeric proteins. Such chimera would consist of those parts of the viral protein necessary for incorporation into the virion as well as sequences meant to interact with specific host cell proteins. Viruses in which the envelope proteins have been replaced as described are referred to as pseudotyped viruses. For example, the most popular retroviral vector for use in gene therapy trials has been the lentivirus Simian Immunodeficiency virus coated with the envelope proteins, G-protein, from Vesicular Stomatitus virus. This vector is referred to as VSV G-pseudotyped lentivirus, and infects an almost universal set of cells. This tropism is characteristic of the VSV G-protein with which this vector is coated. Many attempts have been made to limit the tropism of viral vectors to one or a few host cell populations. This advance would allow for the systemic administration of a relatively small amount of vector. The potential for off-target cell modification would be limited, as well as many concerns from the medical community. Most attempts to limit tropism have used chimeric envelope proteins bearing antibody fragments. These vectors show great promise for the development of "magic bullet" gene therapies.
[editar] Métodos não-virais
Métodos não-virais apresentam algumas vantagens sobre métodos virais: duas delas são produção em larga escala e a baixa imunogenicidade do hospedeiro. Anteriormente, baixos níveis de transfecção e expressão do gene eram desvantagens dos métodos não-virais, mas avanços recentes na tecnologia de vetores permitiram transfecção tão eficiente quanto aquela em métodos virais.
[editar] Naked DNA
This is the simplest method of non-viral transfection. Clinical trials have been carried out of intramuscular injection of a naked DNA plasmid have occurred with some success, however the expression has been very low in comparison to other methods of transfection. In addition to trials with plasmids, there have been trials with naked PCR product, which have had similar or greater success, however this success does not compare to that of the other methods, leading to research into more efficient methods for delivery of the naked DNA such as electroporation and the use of a "gene gun", which shoots DNA coated gold particles into the cell using high pressure gas.
[editar] Oligodeoxynucleotides
The use of synthetic oligodeoxynucleotides in gene therapy is to inactivate the genes involved in the disease process. There are several methods by which this is achieved. One strategy uses antisense specific to the target gene to disrupt the transcription of the faulty gene. Another uses small catalytic molecules of RNA called ribozymes to cleave specific unique sequences in the mRNA transcript of the faulty gene, disrupting translation of the faulty mRNA, and therefore expression of the gene. A further strategy uses double stranded oligodeoxynucleotides as a decoy for the transcription factors that are required to activate the transcription of the target gene. The transcription factors bind to the decoys instead of the promoter of the faulty gene which reduces the transcription of the target gene, lowering expression. pp
[editar] Lipoplexes and polyplexes
To improve the delivery of the new DNA into the cell, the DNA must be protected from damage and its entry into the cell must be facilitated. To this end new molecules, lipoplexes and polyplexes, have been created that have the ability to protect the DNA from undesirable degradation during the transfection process.
Plasmid DNA can be covered with lipids in an organized structure like a micelle or a liposome. When the organized structure is complexed with DNA it is called a lipoplex. There are three types of lipoplexes, anionic (negatively charged), neutral or cationic (positively charged). Initially, anionic and neutral lipids were used for the construction of lipoplexes for synthetic vectors. However, although there is little toxicity associated with them, they are compatible with body fluids and there was a possibility of adapting them to be tissue specific, they are complicated and time consuming to produce so attention was turned to the cationic versions.
Cationic lipids, due to their positive charge, naturally complex with the negatively charged DNA. Also as a result of their charge they interact with the cell membrane, endocytosis of the lipoplex occurs and the DNA is released into the cytoplasm. The cationic lipids also protect against degradation of the DNA by the cell.
The most common use of lipoplexes has been in gene transfer into cancer cells, where the supplied genes have activated tumor suppressor control genes in the cell and decrease the activity of oncogenes. Recent studies have shown lipoplexes to be useful in transfecting respiratory epithelial cells, so they may be used for treatment of genetic respiratory diseases such as cystic fibrosis.
Complexes of polymers with DNA are called polyplexes. Most polyplexes consist of cationic polymers and their production is regulated by ionic interactions. One large difference between the methods of action of polyplexes and lipoplxes is that polyplexes cannot release their DNA load into the cytoplasm, so to this end, co-transfection with endosome-lytic agents (to lyse the endosome that is made during endocytosis, the process by which the polyplex enters the cell) such as inactivated adenovirus must occur. However this isn't always the case, polymers such as polyethylenimine have their own method of endosome disruption.
[editar] Métodos híbridos
Foram desenvolvidos alguns métodos híbridos que combinam duas ou mais técnicas, devido a todo método de transferência genética ter falhas. Virossomos são um exemplo: eles combinam lipossomos com HIV ou vírus da gripe inativos. Esse método se mostrou mais eficiente na transferência de genes em células epiteliais respiratórias do que métodos virais ou lipossomais isolados. Outro método é a mistura de outros vetores virais com lipídios catiônicos.
[editar] Recent developments in gene therapy
Scientist at the National Institutes of Health (Bethesda, MD) have successfully treated metastatic melanoma in two patients using killer T cells genetically retargeted to attack the cancer cells. This study constitutes the first demonstration that gene therapy can be effective in treating cancer. The study results have been submitted for publication.
In May 2006 a team of scientists led by Drs. Luigi Naldini and Brian Brown from the San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET) in Milan, Italy reported a breakthrough for gene therapy in which they developed a way to prevent the immune system from rejecting a newly delivered gene. Similar to organ transplanation, gene therapy has been plagued by the problem of immune rejection. So far, delivery of the 'good' gene has been difficult because the immune sytem does not recognize the new gene and rejects the cells carrying it. To overcome this problem, the HSR-TIGET group utilized a newly uncovered network of genes regulated by molecules known as microRNAs. Dr. Naldini's group reasoned that they could use this natural function of microRNA to selectively turn off the identity of their therapeutic gene in cells of the immune system and prevent the gene from being found and destroyed. The researchers injected mice with the gene containing an immune-cell microRNA target sequence, and spectacularly, the mice did not reject the gene, as previously occurred when vectors without the microRNA target sequence were used. This work will have important implications for the treatment of hemophilia and other genetic diseases by gene therapy [1].
In March 2006 an international group of scientists announced the successful use of gene therapy to treat two adult patients for a disease affecting myeloid cells. The study, published in Nature Medicine, is believed to be the first to show that gene therapy can cure diseases of the myeloid system [2]
University of California, Los Angeles, research team gets genes into the brain using liposomes coated in a polymer called polyethylene glycol (PEG). The transfer of genes into the brain is a significant achievement because viral vectors are too big to get across the "blood-brain barrier." This method has potential for treating Parkinson's disease. See Undercover genes slip into the brain at NewScientist.com (March 20, 2003).
RNA interference or gene silencing may be a new way to treat Huntington's. Short pieces of double-stranded RNA (short, interfering RNAs or siRNAs) are used by cells to degrade RNA of a particular sequence. If a siRNA is designed to match the RNA copied from a faulty gene, then the abnormal protein product of that gene will not be produced. See Gene therapy may switch off Huntington's at NewScientist.com (March 13, 2003).
New gene therapy approach repairs errors in messenger RNA derived from defective genes. Technique has potential to treat the blood disorder thalassaemia, cystic fibrosis, and some cancers. See Subtle gene therapy tackles blood disorder at NewScientist.com (October 11, 2002).
Researchers at Case Western Reserve University and Copernicus Therapeutics are able to create tiny liposomes 25 nanometers across that can carry therapeutic DNA through pores in the nuclear membrane. See DNA nanoballs boost gene therapy at NewScientist.com (May 12, 2002).
Sickle cell is successfully treated in mice. See Murine Gene Therapy Corrects Symptoms of Sickle Cell Disease from March 18, 2002, issue of The Scientist.
The success of a multi-center trial for treating children with SCID (severe combined immune deficiency or "bubble boy" disease) held from 2000 and 2002 was questioned when two of the ten children treated at the trial's Paris center developed a leukemia-like condition. Clinical trials were halted temporarily in 2002, but resumed after regulatory review of the protocol in the United States, the United Kingdom, France, Italy, and Germany. (V. Cavazzana-Calvo, Thrasher and Mavilio 2004; see also 'Miracle' gene therapy trial halted at NewScientist.com, October 3, 2002).
[editar] Problems and ethics
For the safety of gene therapy, the Weismann barrier is fundamental in the current thinking. Soma-to-germline feedback should therefore be impossible. However, there are indications [3] that the Weissman barrier can be breached. One way it might possibly be breached is if the treatment were somehow misapplied and spread to the testes and therefore would infect the germline against the intentions of the therapy.
Some of the problems of Gene Therapy include:
• Short-lived nature of gene therapy - Before gene therapy can become a permanent cure for any condition, the therapeutic DNA introduced into target cells must remain functional and the cells containing the therapeutic DNA must be long-lived and stable. Problems with integrating therapeutic DNA into the genome and the rapidly dividing nature of many cells prevent gene therapy from achieving any long-term benefits. Patients will have to undergo multiple rounds of gene therapy.
• Immune response - Anytime a foreign object is introduced into human tissues, the immune system is designed to attack the invader. The risk of stimulating the immune system in a way that reduces gene therapy effectiveness is always a potential risk. Furthermore, the immune system's enhanced response to invaders it has seen before makes it difficult for gene therapy to be repeated in patients.
• Problems with viral vectors - Viruses, while the carrier of choice in most gene therapy studies, present a variety of potential problems to the patient --toxicity, immune and inflammatory responses, and gene control and targeting issues. In addition, there is always the fear that the viral vector, once inside the patient, may recover its ability to cause disease.
• Multigene disorders - Conditions or disorders that arise from mutations in a single gene are the best candidates for gene therapy. Unfortunately, some of the most commonly occurring disorders, such as heart disease, high blood pressure, Alzheimer's disease, arthritis, and diabetes, are caused by the combined effects of variations in many genes. Multigene or multifactorial disorders such as these would be especially difficult to treat effectively using gene therapy.
• Chance of inducing a tumor - If the DNA is integrated in the wrong place in the genome, for example in a tumor suppressor gene, it could induce a tumor.
[editar] Ver também
[editar] External links
- Gene Therapy: Molecular Bandage? University of Utah's Genetic Science Learning Center
- The American Society of Gene Therapy
- The European Society of Gene Therapy
- 2003 news relating to gene therapy
- Research Group at Cambridge, UK working on an overcoming current hurdles to successful gene therapy
- Council for Responsible Genetics
[editar] Referências
- Predefinição:Cite journal
- Predefinição:Cite journal
- Staff (November 18, 2005). Gene Therapy (FAQ). Oak Ridge National Laboratory. Acessado em May 28.
- Baum C, Dullmann J, Li Z, Fehse B, Meyer J, Williams DA, von Kalle C. Side effects of retroviral gene transfer into hematopoietic stem cells. Blood. 2003 Mar 15;101(6):2099-114
- Horn PA, Morris JC, Neff T, Kiem HP. Stem cell gene transfer--efficacy and safety in large animal studies. Molecular Therapy, 2004 Sep;10(3):417-31
- Predefinição:Cite journal
